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诱导多能干细胞的方法与材料:从人体皮肤活检中获得成纤维细胞培养物

标签:诱导多能干细胞

在此篇文章中,从国外实验从人体皮肤活检中获得成纤维细胞培养物,讲述了其诱导多能干细胞的方法与材料。


在签署患者知情同意书后,对前臂皮肤进行活检。活检保存在DMEM培养基,15%胎牛血清,2mM谷氨酰胺,50 U / ml青霉素-链霉素中将相同的组成用于成纤维细胞的进一步培养数小时。将一滴培养基中的外植体放在培养皿的盖子上,并用锋利的手术刀切成小块。将得到的碎片分别放在单独的35 mm培养皿中或3-4在6 cm培养皿中,并用无菌盖玻片压在顶部。将培养基倒在玻璃上。一周后,将介质更换为新鲜介质,以免移动盖玻片。大约3周后。


诱导多能干细胞


慢病毒载体的细胞感染:将聚乙烯细胞添加到培养基中,浓度为8μg/ ml。一小时后,将所需量的病毒上清液加入到具有细胞的培养基中。慢病毒载体滴度的测定:用含有各种稀释度的病毒载体的上清液感染凤凰细胞。感染后48小时,将细胞固定,并使用针对相应抗原的抗体进行免疫组织化学分析。病毒的滴度由染色细胞的百分比确定。


在饲养层上培养胚胎干细胞(ESC)和人iPSC:在饲养条件下培养人类ESC和iPSC的培养基具有以下成分:DMEM / F12,20%血清替代品,2 mM L-谷氨酰胺,0.1 mMβ-巯基乙醇,1%氨基酸混合物,青霉素链霉素(50 U / ml;50μg/ ml),bFGF 4 ng / ml。线粒体灭活的小鼠胚胎成纤维细胞用作培养基质。每天更换介质。每隔5-7天使用1 mg / ml分散酶对细胞进行传代。


在无饲养层条件下培养人类ESC和iPSC:培养在用于人ESC mTESR1的无饲养者培养的培养基上进行。Matrigel被用作培养的载体。根据制造商的说明制备基质胶包被的培养皿和平板。每天更换介质。每隔5-7天使用1 mg / ml分散酶对细胞进行传代。


胚状体的形成与培养:用于培养拟胚体的培养基具有以下成分:DMEM / F12,20%FBS,2 mM L-谷氨酰胺,0.1 mMβ-巯基乙醇,1%的氨基酸混合物,青霉素-链霉素(50 U / ml; 50μg/ ml)。胚状体的形成如下进行。用分散酶捕获iPSC的菌落。为此,除去培养基,将细胞用PBS洗涤,将0.5 ml 1 mg / ml分散酶溶液添加到35 mm皿中,并将细胞在37°C下孵育7-10分钟。


然后除去酶溶液,用DMEM / F12洗涤4次,并加入1ml培养基。用塑料尖 端刮掉菌落5–200μL,小心分离成碎片(400–600个细胞),离心,除去上清液,将沉淀物悬浮在用于培养拟胚体的培养基中,并转移至具有极低粘附力的超低粘附力培养皿上的培养皿中。次日,ESC形成了浮动的圆形聚集体。星期三隔天更改。在培养的第4-5天,胚状体的大小增加,并且开始出现空洞。


iPSC和ESC的自发分化:将10–20天的胚状体转移到明胶包被的培养皿中,用于培养胚状体,胚状体附着在凝胶状基质上,细胞开始从胚状体向培养皿表面迁移,2-3周后,形成了广泛区域的分化细胞。


获取iPSC:将在第 一代冷冻的皮肤成纤维细胞解冻,并在35mm培养皿上的成纤维细胞培养基中接种约40,000个细胞,铺板后2天,将细胞用各种量和比例的四种原始慢病毒载体(LeGO-hOCT4,LeGO-hSOX2-IRES-GFP,LeGO-hc-Myc,LeGO-hKLF4)感染,感染后5天,将细胞在各种底物上继代培养1至12:塑料,明胶,Matrigel和在成纤维细胞培养基中有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞,继代培养后的次日,将培养基更换为用于在饲养条件下培养ESC的培养基。


然后将细胞在这种培养基中培养10-12天,每2天更换一次培养基。到此时,在平板上已经形成了许多具有不同形态的克隆,将这些克隆进行机械传代培养,并在无饲养器的ESC培养条件下分别培养。在重新编程的过程中,在感染后的第 一周,将丙戊酸(VPA)添加到培养基中,浓度为1 mM,将BIX-01294添加到培养基中,浓度为2μM。感染后第三周,或完全不添加。


iPSC分化为神经细胞:为了诱导神经元分化,将iPSCs培养至亚汇合,然后如上所述用分散酶处理,然后转移到覆盖有明胶的新培养皿中,并在含1%N2的DMEM / F12中培养,2%血清替代品,50 ng / ml头蛋白。每隔一天更改星期三。10-14天后,玫瑰花样结构开始出现在培养物中。


2周后。培养时,可以使用塑料尖 端将可能占细胞总数高达70%的玫瑰花结与其他培养细胞机械分离,然后直接诱导分化,或者将培养物转移到悬浮液中,并以极低粘附力的超低粘附力平板形式培养为神经球。在DMEM / F12培养基中添加N2,含有20 ng / ml EGF,20 ng / ml bFGF的平板。将神经球培养两周。


为了分化,将玫瑰花结期或神经球期的细胞培养在涂有明胶的塑料上。为了区分神经元,将10 ng / ml BDNF添加到基础培养基中,而不是EGF和bFGF和5 ng / ml GDNF,继续培养2周。插座和神经球7-10天。


在此次诱导多能干细胞的方法与材料获得结果与讨论:对于模拟人类疾病的任务,即体外研究,iPSC生产方案的一些特性如简单,低成本和可重复性成为人们关注的焦点。迄今为止,已经可以使用许多不同的将转基因递送至细胞的方法来获得iPSC:逆转录病毒载体,piggyBAC转座子,质粒载体的瞬时转染等。我们选择了一种将转录因子传递到细胞中的慢病毒方法,因为该方法已广泛用于重编程实验中,并且开发完善。


基于LeGO载体系统设计了原始质粒[8]LeGO-hOCT4,LeGO-hSOX2-IRES-GFP,LeGO-hc-Myc,LeGO-hKLF4,用于组装分别携带转录因子OCT4,SOX2,c-Myc和KLF4的慢病毒载体。与山梨葡萄球菌实验室的质粒不同,在我们原始的质粒中,转基因的两侧是LoxP位点,可以将其从细胞的基因组DNA中去除。


我们比较了基于山梨链球菌实验室质粒和我们原始质粒的慢病毒载体的装配效率。与山中S.山中实验室的质粒相比,新质粒提供的慢病毒载体组装效率高一个数量级,导致上清液中病毒载体的滴度更高(数据未显示)。这使得有可能在使用前放弃慢病毒载体的浓缩,从而简化了它们的工作。

广州多能—走进2020创交会

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2020年9月23日,多能干细胞科技(广州)有限公司受邀走进由中国科协、国家发展改革委、中国科学院、中国工程院、九三学社中央和广东省人民政府、广州市人民政府主办,广州市人民政府、国际数据集团承办的2020中国创新创业成果交易会(下称:创交会)在广州正式开幕。

2019-01-13

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