多能干细胞分化的注意事项

选择细胞来源和发展，在多能干细胞分化考虑到它们的可扩展性和多功能性，多能干细胞代表了一种特别有吸引力的细胞来源。但是，对于大多数人类多能干细胞来源的谱系，仍然存在的主要挑战是利用这些细胞的广泛分化潜能来产生适合临床使用的细胞产物。对于仅在发育的后期才发挥其全部功能的细胞类型，例如具有成年归巢能力的造血干细胞，具有成年状生理学的心脏细胞和胰腺细胞，它们响应葡萄糖刺激而显示出正常的调节作用，这一问题尤其严重。当前的人类多能干细胞分化策略产生的分化细胞类型与胚胎或胎儿发育阶段较接近。

因此，利用控制正常发育的信号通路已发展成为指导人类多能干细胞命运的强大策略。一个明显的问题是，对发育要求的更好理解是否将使研究人员能够克服人类多能干细胞分化中剩余的障碍，并为我们体内的任何细胞类型建立方案。在某些情况下，例如在骨骼肌前体的情况下，早期基于人类多能干细胞的协议不够强大，无法产生大量可移植的成肌细胞。

但是，在hESC衍生的细胞中观察到更有效的植入，包括功能整合到营养不良小鼠的肌肉中，并诱导了成对盒蛋白PAX-7的表达。有趣的是，精致的构图策略是否将能够使用纯外部信号来衍生分化的细胞（包括骨骼肌），或者在某些细胞谱系的规范中是否仍需要瞬时或稳定的基因修饰。定向分化的新发展的例子在下面讨论。

小分子的使用是改善基于人类多能干细胞的定向分化方案的重要工具。小分子通常比重组蛋白因子便宜，并且显示出更高的效能和可扩展性；它们还能够直接操纵细胞内途径。有趣的是，脱靶效应并未在定向分化范例中引起实质性问题。基于小分子的研究的另一个令人惊讶的特征是，在某些情况下，抑 制信号传递而不是激活信号通路对于决定命运至关重要。在神经诱导的情况下，BMP和Nodal-activin-TGFβ信号传导的联合抑 制作用（即dSMADi）已成为生成特定神经谱系的强大平台。

这种方法的主要优点是神经感应的高度同步和有效，可实现细胞的准确时间模式。对于内胚层衍生物，例如肺和甲状腺谱系的细胞的规格，已经采用了类似的方法。为了突破这种方法的局限性，我们近期描述了一种快速诱导方案，该方案可在五天内使用五种抑 制剂组合产生人类多能干细胞衍生的神经元。因此，通过靶向BMP，Nodal-activin-TGFβ，成纤维细胞生长因子（FGF），Notch和WNT信号通路，以前所 未有的速度获得了医学上重要的神经元，例如疼痛感应伤害感受器。

组合的小分子方法可能适用于其他人类多能干细胞衍生的血统，例如胰腺前体。能够在体外缩短人类细胞命运规范时间的能力，如快速诱导人类伤害感受器所示可能是一种有用的策略，可以简化对少突胶质细胞和皮质中间神经元等晚期和晚期细胞类型的诱导。小分子方法的效果在改善直接神经诱导方案方面尤为明显。然而，小分子被广泛应用于各种神经诱导范例，包括进料器为基础的和胚状体为基础的神经分化的hESC为或iPSC的协议。

在三个维度上的自组织和分化。适当的三维细胞结构的建立是几种细胞类型的关键特征。例如，尽管使用人类多能干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞治疗黄斑变性的初始临床试验是基于注射离体细胞，人们已经进行了广泛的努力来产生RPE细胞片，以确保在移植到患者眼中后这些细胞的正确组织。三维聚集体的形成已成为几种近期定向分化方案的特征，例如从小鼠胚胎干细胞衍生垂体细胞，产生人或小鼠视杯样结构以及衍生皮质和脑类器官来自hESC的48种培养物以及肠隐窝结构。

在这种情况下，主要策略是使人类多能干细胞脱颖而出，以揭示其自我组织能力。不需要任何特定的外部线索的特性。在自组织范式中确实会影响分化过程的参数包括初始细胞密度和总体培养基组成。这些研究中的一些还依赖于特定细胞外基质成分的使用，例如人类多能干细胞衍生的脑类器官，它们需要在类器官结构形成之前将早期的神经花环嵌入基质胶塞中。通过操纵细胞外基质成分来指导人类多能干细胞的分化已发展成为针对各种人类多能干细胞衍生谱系的策略，例如血管细胞，骨和软骨，这种方法可能适用于许多其他谱系。

但是，三维组织的相对要求是可变的。例如，近期一项使用hESC衍生的心肌细胞的研究报道了在豚鼠心脏中，移植的心肌细胞与宿主细胞功能整合和偶联的证据，而无需在移植前进行细胞组装。同样，在帕金森氏病模型中进行的胎儿中脑移植研究被认为是未来人类多能干细胞移植范例的“金标准”，与细胞悬浮移植相比，在完整细胞结构的组织块移植中没有任何益处。三维组织可能已部分克服了人类多能干细胞分化中的功能瓶颈的一个例子是建立了可移植的肝芽样结构。在这个例子中，与内皮细胞和间充质细胞共培养产生的结构在产生关键肝酶时显示出改善的功能。